发布日期：2024-12-24 11:38    点击次数：84

杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.]具有速生、高产、材质优良等特色，其东说念主工林面积及蓄积量均位列我国用材树种首位[1]。杉木涩籽属于一类败育种子，其外不雅、大小、分量、明后等表型特征与具备闲居萌生才能的健籽极为通常，难以用浅显才能鉴别[2]。已有报说念以为西风萝莉恋足，类黄酮类代谢物过头下贱养殖物单宁类代谢物是涩籽的主要填充物资[3-8]。类黄酮类代谢物是2个具有酚羟基的苯环通过三碳键链接的一类代谢物的统称[9]，粗俗存在于植物各组织器官中，具有影响组织明后[10-11]、拒抗病原体[12-13]、抗氧化[14-15]、参与信号传递[16-17]等功能。类黄酮类代谢物对植物种子发育的影响主要体目下协同调控种胚助长素水平[18-22]、影响胚乳脂质代谢[23-24]、调控microRNA抒发[25-26]等方面，其特别积存可形成种胚败育[8]。

杉木涩籽中类黄酮类代谢物约占38.3%，是健籽的2倍[7]，其种类普及140种，包括黄酮、黄烷酮、黄酮醇、异黄酮、黄酮碳糖苷、黄酮木脂素、花青素、儿茶训诫殖物等多种类型[8]。目下，估量杉木涩籽发生经由中类黄酮类代谢物的合成、养殖及变化尚未明确。因此，本研究以涩籽率极高(90%)和极低(24%)的2个杉木家系种子为研究对象，比拟种子发育经由中类黄酮类代谢物含量、酶活性及调控基因相对抒发量的动态变化与相反，以探明涩籽形成经由中类黄酮类代谢物的积存特征，为进一步揭示杉木涩籽形成机制提供参考。

1 材料与才能 1.1 检会材料

供试样品取自福建省尤溪国有林场杉木3代种子园。字据本课题组前期对该种子园不同家系的种检数据，筛选出涩籽率分别为24%(L家系)和90%(H家系)的2个家系。2019年3月进行东说念主工授粉，分别于授粉后70、80、90、100、110 d取样。各家系就地及第大小适中、无显著病虫害和机械损害、位于树冠中部归拢旦向的球果30枚。清洗球果名义灰尘后速即置入液氮中速冻15 min，置于干冰中带回推行室。在干冰上速即剥出种胚，置入浸于液氮中的无菌离心管，于-80 ℃超低温雪柜保存备用。

1.2 测定姿色及才能 1.2.1 类黄酮类代谢物含量

(1) 总黄酮与花青素含量接收试剂盒法测定。分又名取0.1 g种子样品，充分研磨后加入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液，1 000 g离心20 min，取上清液。按照ELISA酶联免疫试剂盒讲明书处分后测定450 nm处的光密度，以模范品绘制模范弧线并接洽样品浓度。(2)槲皮素、山奈酚和杨梅素含量接收高效液相色谱法测定。称取0.5 g样品置于添加甲醇∶25%盐酸水溶液=4∶1(体积比)的研钵中，充分研磨成匀浆，经80 ℃水浴1.5 h后进行超声索求，10 000 g离心10 min，取上清液，过滤后进样检测。液相色谱检测条目为：C18色谱柱(4.6 nm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇∶0.2%磷酸=60∶40；流速0.8 mL·min-1，检测波长360 nm，柱温35 ℃。(3)儿茶素和表儿茶素接收高效液相色谱法测定。取0.5 g样品充分研磨后，按液料比为35∶1(mL∶g)溶于5 mL 60%酒精溶液中，在50 ℃下回流索求3 h，所得溶液过滤后冷冻干燥。将干燥后的粉末复溶于5 mL 50%甲醇溶液中，过0.45 μm滤头后进样检测。液相色谱检测条目：A相为体积分数为0.05%的硫酸水溶液，B相为甲醇；流速为0.5 mL·min-1；柱温30 ℃。

1.2.2 酶活性

接收ELISA酶联免疫试剂盒法检测查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、黄烷酮3′羟基化酶、二氢黄酮醇4-规复酶、黄酮醇合成酶、无色花青素规复酶、花青素合成酶和花青素规复酶等8种要津酶活性。按照试剂盒讲明书，哄骗模范品绘制模范弧线并接洽线性追思方程。哄骗1.2.1中总黄酮含量测定检会所制备的索求液测定452 nm处光密度，并接洽酶活性。

1.2.3 调控基因相对抒发量

以天根多糖多酚植物RNA索求试剂盒索求种种品RNA，测定查尔酮合成酶基因(CHS)、查尔酮异构酶基因(CHI)、黄烷酮3′羟基化酶基因(F3′H)、二氢黄酮醇4-规复酶基因(DFR)、黄酮醇合成酶基因(FLS)、无色花青素规复酶基因(LAR)、花青素规复酶基因(ANR)等7个要津调控基因的相对抒发量。以全式金TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix回转录试剂盒制备样品cDNA，以primer 5.0软件盘算各基因引物(表 1)，并字据引物序列的退火温度进行PCR扩增。以Trans PCR SuperMix试剂盒进行PCR家具回收。以全式金TA克隆汇集试剂盒进行克隆汇集，并将汇集家具置于Trans1-T1感受态细胞中培养。挑选白色单克隆体进行PCR阳性克隆果决。以EasypureHiPureMaxiPrep Kit质粒索求试剂盒索求质粒，全式金2xTransTap High Fidelity PCR SuperMix试剂盒进行荧光定量测定。以EF-1α模范质粒为内参，双模范弧线法配置Rt-PCR的模范弧线。以授粉后70 d时H家系各基因单元细胞拷贝数为参照，作念归一化处分取得各基因的相对抒发水平。

1.3 数据处分

以Origin V9.64软件对数据进行基本处分并绘制；以RStudio软件进行皮尔逊干系性分析；以TBtools的Heatmap功能绘制热图[27]。

2 恶果与分析 2.1 杉木涩籽类黄酮合成路线代谢物含量比拟

不同杉木家系种子类黄酮类代谢物含量过头变化趋势相反显著(图 1)。由图 1可知，授粉后70~110 d，L家系总黄酮含量变化不大；授粉后90~110 d，2个家系总黄酮含量相反冉冉扩大，至110 d时H家系总黄酮含量为L家系的2.17倍，且相反达极显赫水平。花青素、槲皮素、山奈酚、杨梅素和儿茶素等中间代谢物含量举座上弘扬为H家系显著高于L家系。其中，H家系花青素含量随时辰变化呈高潮趋势，L家系则相背，授粉后70~80 d二者之间相反不显赫，90~110 d则呈极显赫相反，授粉后110 d相反最大，达6.45倍。H家系槲皮素和山奈酚含量均随时辰变化呈先下跌后高潮的趋势，且授粉后70~90 d显赫或极显赫高于L家系。L家系杨梅素含量呈显著的下跌趋势，授粉后70 d杨梅素含量高于H家系；随后H家系杨梅素含量快速高潮，至授粉后110 d达到L家系的7.84倍，相反达极显赫水平。H家系儿茶素含量呈显著的高潮趋势，而L家系则先高潮后下跌，并在授粉后90 d达到最高值；授粉后70~90 d，2个家系儿茶素含量相反不显赫；授粉后110 d，H家系儿茶素含量为L家系的2.44倍，相反极显赫。表儿茶素含量弘扬与上述几种代谢物相背，授粉后80~110 d，H家系表儿茶素含量极显赫低于L家系。

2.2 杉木涩籽类黄酮合成路线要津酶活性比拟

2个家系间类黄酮合成路线要津酶活性存在相反(图 2)。由图 2可知，授粉后70 d，H家系查尔酮合成酶活性显赫低于L家系，查尔酮异构酶和二氢黄酮醇4-规复酶活性则极显赫低于L家系；授粉后80~110 d二者无显赫相反。H家系黄烷酮3′羟基化酶、黄酮醇合成酶和无色花青素规复酶活性总体上高于L家系。其中，H家系黄烷酮3′羟基化酶活性随时辰变化呈显著的高潮趋势，而L家系仅在授粉后70~90 d有所高潮，之后活性水平趋于平安；授粉后70~80 d，2个家系黄烷酮3′羟基化酶活性水平相反不显赫，90~110 d则呈现显赫或极显赫的相抗争平。L家系黄酮醇合成酶和无色花青素规复酶活性均随时辰变化而冉冉下跌，授粉后100、110 d两种酶活性信号均已越过微小，而H家系中这两种酶活性均较高；授粉后70~110 d，， 2个家系间无色花青素规复酶活性相反均达极显赫水平，黄酮醇合成酶活性除授粉后70 d两者无显赫性相反外，其他时辰两者相反均达极显赫水平。H家系花青素合成酶活性随时辰变化呈先高潮后下跌再高潮的动态变化趋势；L家系则呈先高潮后下跌趋势，授粉后80 d活性最高；授粉后70 d，H家系花青素合成酶活性极显赫低于L家系，授粉后100、110 d则极显赫高于L家系。H家系花青素规复酶活性随时辰变化呈冉冉升高趋势，L家系则呈先下跌后高潮再下跌的动态变化趋势，授粉后70~90 d，H家系花青素规复酶活性极显赫低于L家系，100、110 d则显赫高于L家系。

2.3 杉木涩籽类黄酮合成路线要津基因抒发

2个家系类黄酮生物合成路线要津基因相对抒发量见图 3。2个家系种子的CHS、CHI相对抒发量随时辰变化呈先下跌后高潮趋势，且H家系均低于L家系。其中，两个家系的CHI相对抒发量在授粉后90 d相反显赫，其他处分相反均达极显赫水平；CHS相对抒发量在授粉后90~110 d相反极显赫。H家系的F3′H相对抒发量总体上随授粉天数变化而冉冉升高，而L家系则呈先高潮后下跌的趋势；授粉后70~90 d，H家系F3′H相对抒发量极显赫低于L家系，授粉后110 d则极显赫高于L家系。2个家系DFR相对抒发量均呈先高潮后下跌的趋势，授粉后90 d最大，除授粉后70 d二者无显赫相反外，其他时辰H家系均显赫或极显赫高于L家系。H家系FLS相对抒发量随时辰变化呈“W”型变化趋势，而在L家系中未检测到FLS基因的抒发信号。L家系LAR与ANR的相对抒发量均高于H家系，授粉后70~80 d两个家系的LAR相对抒发量变化呈相背的趋势，80~110 d则均呈高潮趋势，并在授粉后110 d相反达显赫水平；授粉后70~110 d，H家系ANR相对抒发量均极显赫低于L家系。

2.4 类黄酮类代谢物含量与酶活性及调控基因相对抒发的干系性

杉木涩籽类黄酮类代谢物含量与要津酶活性、调控基因相对抒发的干系性分析如表 2所示。概括干系性总计和显赫性主义，两个家系中与主要代谢物含量变化显赫干系的酶活性及基因抒发有所不同。L家系的总黄酮含量与查尔酮异构酶活性及CHS、LAR和ANR的抒发呈显赫正干系；H家系则与查尔酮异构酶、二氢黄酮醇4-规复酶、花青素合成酶活性及ANR的相对抒发量呈显赫正干系。L家系的花青素含量与查尔酮合成酶活性及CHS、CHI和ANR相对抒发量呈显赫正干系，与黄酮醇合成酶、无色花青素规复酶活性呈显赫负干系；H家系则与查尔酮合成酶、黄烷酮3′羟基化酶、二氢黄酮醇4-规复酶、花青素规复酶活性及CHI和LAR相对抒发量呈显赫负干系。L家系的槲皮素含量与花青素合成酶活性呈显赫负干系；H家系则与酶活性和基因相对抒发量的干系性均不显赫。L家系山奈酚含量与酶活性和基因抒发的干系性均不显赫；H家系则与查尔酮异构酶、花青素合成酶活性呈显赫负干系。L家系杨梅素含量与二氢黄酮醇4-规复酶活性呈显赫正干系，与花青素规复酶活性呈显赫负干系；H家系则与查尔酮合成酶、黄烷酮3′羟基化酶、二氢黄酮醇4-规复酶活性呈显赫负干系。L家系儿茶素含量与黄烷酮3′羟基化酶活性呈显赫正干系，与黄酮醇合成酶活性呈显赫负干系；H家系则与DFR的相对抒发量呈显赫正干系。两个家系表儿茶素含量与酶活性和基因抒发的干系性均不显赫。

赤裸裸家政妇在线观看 2.5 类黄酮生物合成路线相反性分析

通过比对不错看出(图 4)，上游的查尔酮合成酶和异构酶活性在两个家系间的相反不大，其编码基因CHS和CHI则在H家系中呈相对下调抒发。中游的3个要津酶过头调控基因中，黄酮醇合成酶过头编码基因FLS在两个家系中的相反最为显著，在H家系中均为显赫上调抒发，其家具槲皮素、山奈酚和杨梅素含量也呈显著的上调趋势。下贱的3个要津酶过头调控基因中，无色花青素规复酶活性有显著上调，其调控家具儿茶素含量也小幅上调，但编码基因LAR相对抒发量的变化幅度不大。花青素规复酶编码基因ANR过头调控家具表儿茶素均有显著的下调弘扬，但其酶活性相反不大。

3 探究

杉木涩籽形成经由中存在种胚萎缩败育和种腔被大批次生代谢物填充两个显著特征。早期研究以为，涩籽内的次生代谢物资主要为单宁类过头养殖物[3-7]；而近期研究发现，在涩籽发生初期，包括黄酮、黄酮醇、黄酮炭糖苷、黄烷酮、异黄酮和花青素等类黄酮类代谢物过头养殖物的含量较高[8]。本研究标明，涩籽率较高的H家系种子发育经由中总黄酮和槲皮素、山奈酚、杨梅素、儿茶素、花青素等类黄酮生物合成路线中的病笃代谢物含量显著高于L家系，标明涩籽发育初期类黄酮类次生代谢物资出现特别积存，这与林小琴[28]的研究恶果相符。

查尔酮合成酶是类黄酮生物合成路线的第一个限速酶，其催化苯丙烷代谢路线的家具丙二酰辅酶A与香豆酰辅酶A或咖啡酰辅酶A缩合形成类黄酮生物合成路线的病笃中间家具查尔酮[29]。在植物生殖发育系统中，查尔酮合成酶编码基因CHS被以为与雄性生殖锻真金不怕火估量，通过干与CHS抒发粗略退却雄配子体的发育，进而影响胚胎形成[30]。杉木授粉期约在2月中旬至3月上旬，而受精期则在5月中旬[31]。授粉后小孢子快要2个月停留在大孢子珠孔隔壁[32]，加之杉木球果种鳞为半盛开气象，难以严实保护，使种胚发育易受外界环境的影响。H家系中CHS的下调抒发反应了小孢子的特别发育可能与涩籽形成估量。

H家系中黄酮醇合成酶活性过头编码基因FLS的相对抒发量均出现较大幅度的上调西风萝莉恋足，同期槲皮素、山奈酚和杨梅素含量也显著加多，标明涩籽中二氢黄酮醇更趋向于向黄酮醇类代谢物标的衍化，尤其是杨梅素含量加多趋势最为显著，可见涩籽种胚内细胞的应激系统处于激活气象。干系研究标明，涩籽形成初期种胚上部开动冉冉萎缩，细胞残害解体[31]，同期杨梅素已被说明参与多莳植物困境应激生理举止[33-34]，这也印证了本文的揣摸。另外，黄酮醇类代谢物的其他下贱家具，如儿茶素和花青素含量也有显著加多，这可能与底物含量的加多估量，也可能是由于涩籽内抗氧化酶系活性下跌，相应的抗氧化类次生代谢物取悦活性氧才能下跌而导致活性氧积存所形成。

• 西风萝莉恋足
• 形成
• 山木
• 种类
• 色仔

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